Prime editing

Em biologia molecular, prime editing, edição de primer ou edição genômica por transcrição reversa guiada, é um método de edição de genoma que grava diretamente novas informações genéticas em um sítio de DNA especificado usando uma endonuclease Cas9 prejudicada cataliticamente e fundida a uma transcriptase reversa projetada, programada com um RNA de guia prime de edição (pegRNA) que especifica o sitío de destino e codifica a edição desejada.[1] Ele pode adicionar mais precisão e flexibilidade ao método de edição CRISPR.[2] Ele medeia inserções, deleções e todas as doze conversões possíveis de base.

Prime editing é mais complexo que a edição CRISPR. Ele pode excluir comprimentos longos de DNA causador de doença ou inserir DNA para reparar mutações perigosas, tudo sem desencadear as respostas caóticas (e possivelmente prejudiciais) do genoma introduzidas por outros métodos baseados em CRISPR.[3] Requer três etapas separadas nas quais o DNA deve corresponder a partes do sistema prime de edição.[4][5]

Prime editing foi desenvolvido por David Liu, que também é o fundador da Beam Therapeutics[6] no Broad Institute.[7]

Processo de desenvolvimento

Durante o desenvolvimento dessa tecnologia, várias modificações foram feitas nos componentes, a fim de aumentar seus efeitos.[8]

Sistema prime de edição 1

No primeiro sistema, uma transcriptase reversa do vírus da leucemia murina Moloney (M-MLV) de tipo selvagem foi fundida com o terminal C da nickase Cas9 H840A. Foram observadas eficiências de edição detectáveis.

Sistema prime de edição 2

A fim de aumentar a afinidade DNA-RNA, processabilidade enzimática e termoestabilidade, cinco substituições de aminoácidos foram incorporadas na transcriptase reversa M-MLV. O mutante M-MLV RT foi então incorporado no sistema prime de edição 1 (PE1) para dar origem a (Cas9 (H840A) -M-MLV RT (D200N / L603W / T330P / T306K / W313F)). Melhoria da eficiência foi observada em relação ao PE1.[9]

Sistema prime de edição 3

Apesar de sua eficácia aumentada, a edição inserida pelo PE2 ainda pode ser removida devido ao reparo de incompatibilidade de DNA da fita editada. Para evitar esse problema durante a resolução heteroduplex de DNA, é introduzido um RNA guia único adicional (sgRNA). Este sgRNA foi projetado para corresponder à sequência editada introduzida pelo pegRNA, mas não ao alelo original. Ele direciona a porção Cas9 nickase da proteína de fusão para cortar a fita não editada em um local próximo, oposto à incisão original. Fazer a incisão na fita não editada faz com que o sistema de reparo natural da célula copie as informações na fita editada na fita complementar, instalando permanentemente a edição.[1]

Edição dupla prime

A "edição dupla prime" ("twin prime editing" - twinPE) concentrava-se em mutações menores, desde substituições de base única até inserções e deleções de dezenas de pares de bases, mas não conseguia corrigir sequências mais longas, como variantes estruturais causadoras de doenças.[10] Consequentemente, Anzalone e Liu criaram uma edição dupla prime, nomeada em homenagem à conjectura de primos gêmeos em matemática.[11] Ao criar dois flaps que se sobrepõem no meio, os pesquisadores poderiam editar um trecho maior de DNA fazendo com que um pegRNA editasse a primeira metade e o outro editasse a segunda metade.[12]

Vantagens

  • Prime editing amplia o alcance da edição do genoma CRISPR, pois pode editar perto ou longe de sites PAM, tornando-o menos restrito à disponibilidade de PAM, como outros métodos.
  • Os editores de base desenvolvidos até o momento só podem criar um subconjunto de alterações (C-> T, G-> A, A-> G e T-> C). O prime editing permite todas as 12 alterações possíveis de base para base.[13][14][15]

Produção

A Prime Medicine e a Beam Therapeutics compartilharão conhecimento no prime editing e nas tecnologias associadas, como entrega e fabricação. O relacionamento entre essas empresas foi desenvolvido para maximizar os interesses dos pacientes, para que o maior número possível de pacientes possa se beneficiar da base editing ou da tecnologia de prime editing.[3]

Referências

  1. 1 2 Anzalone, Andrew V.; Randolph, Peyton B.; Davis, Jessie R.; Sousa, Alexander A.; Koblan, Luke W.; Levy, Jonathan M.; Chen, Peter J.; Wilson, Christopher; Newby, Gregory A. (dezembro de 2019). «Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA». Nature (em inglês). 576 (7785): 149–157. ISSN 1476-4687. doi:10.1038/s41586-019-1711-4
  2. ↑ Tsang, Jennifer. «Prime Editing: Adding Precision and Flexibility to CRISPR Editing». blog.addgene.org (em inglês). Consultado em 6 de novembro de 2019
  3. 1 2 «Scientist David Liu takes your questions on CRISPR and prime editing». STAT (em inglês). 6 de novembro de 2019. Consultado em 12 de novembro de 2019
  4. ↑ «New "Prime Editing" Method Makes Only Single-Stranded DNA Cuts». The Scientist Magazine® (em inglês). Consultado em 6 de novembro de 2019
  5. ↑ «Prime Editing the Genome». NeuroLogica Blog. 22 de outubro de 2019. Consultado em 6 de novembro de 2019
  6. ↑ «David Liu unveils newest advancement in CRISPR tech: Prime editing». Endpoints News (em inglês). Consultado em 12 de novembro de 2019
  7. ↑ Gallagher, James (21 de outubro de 2019). «DNA tool could correct 89% of genetic defects» (em inglês)
  8. ↑ Anzalone, Andrew V.; Randolph, Peyton B.; Davis, Jessie R.; Sousa, Alexander A.; Koblan, Luke W.; Levy, Jonathan M.; Chen, Peter J.; Wilson, Christopher; Newby, Gregory A. (dezembro de 2019). «Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA». Nature. 576 (7785): 149–157. ISSN 0028-0836. PMC 6907074Acessível livremente. PMID 31634902. doi:10.1038/s41586-019-1711-4
  9. ↑ Anzalone, Andrew V.; Randolph, Peyton B.; Davis, Jessie R.; Sousa, Alexander A.; Koblan, Luke W.; Levy, Jonathan M.; Chen, Peter J.; Wilson, Christopher; Newby, Gregory A. (outubro de 2019). «Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA». Natur (em inglês). 576 (7785): 149–157. ISSN 0028-0836. doi:10.1038/s41586-019-1711-4
  10. ↑ «Evolved prime editors are smaller and more efficient for therapeutic applications». Broad Institute (em inglês). 31 de agosto de 2023. Consultado em 14 de novembro de 2023
  11. ↑ Anzalone, Andrew V.; Gao, Xin D.; Podracky, Christopher J.; Nelson, Andrew T.; Koblan, Luke W.; Raguram, Aditya; Levy, Jonathan M.; Mercer, Jaron A. M.; Liu, David R. (maio de 2022). «Programmable deletion, replacement, integration and inversion of large DNA sequences with twin prime editing». Nature Biotechnology (em inglês) (5): 731–740. ISSN 1546-1696. doi:10.1038/s41587-021-01133-w. Consultado em 14 de novembro de 2023
  12. ↑ «Prime Editing Comes of Age». The Scientist Magazine® (em inglês). Consultado em 14 de novembro de 2023
  13. ↑ Anzalone, Andrew V., et al. "Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA." Nature (2019): 1-1. PubMed PMID: 31634902.
  14. ↑ Komor, Alexis C., et al. "Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage." Nature 533.7603 (2016): 420. PubMed PMID: 27096365. PubMed Central PMCID: PMC4873371.
  15. ↑ Rees, Holly A., and David R. Liu. "Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells." Nature reviews genetics 19.12 (2018): 770-788. PubMed PMID: 30323312. PubMed Central PMCID: PMC6535181.
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